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Introduzione all'HPLC

Benvenuti  nel sito dell' HPLC  

Inquesta pagina , spieghiamo un po di Teoria     

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  COLONNA 


La cromatografia su colonna è nota sin dall'inizio del 1900. Utilizza una colonna di vetro munita di un rubinetto all'estremità inferiore e riempita della fase stazionaria (che è diversa secondo la sostanza da esaminare. In alcuni casi può essere conveniente, avvenuta la separazione cromatografica della miscela in diverse zone separatesi lungo la colonna, estrarre questa dal tubo di vetro che la contiene, tagliandola in modo da separare le singole zone. Ciascuna sostanza può, poi, venire ricavata dalla zona di materiale adsorbente che la contiene eluendola separatamente mediante un solvente adatto. Talvolta risulta conveniente condurre la cromatografia a temperatura superiore a quella ambiente: a caldo l'equilibrio di ripartizione tra fase fissa e fase mobile si stabilisce più rapidamente e le separazioni ottenute risultano perciò più nette. Allo scopo ci si serve di tubi per cromatografia muniti di una camicia termostatica, che consente di mantenere la colonna alla temperatura voluta. La miscela delle sostanze che si vogliono separare forma all'inizio una sottile zona all'estremità superiore della colonna; se si sceglie opportunamente la fase mobile, allorché questa viene fatta percolare lungo la colonna, i singoli componenti della miscela in esame migrano con velocità diversa come bande abbastanza ristrette.
A seconda dei valori del coefficiente di ripartizione tra le due fasi e dei loro rapporti, si possono distinguere tre diversi metodi di eluizione:

    1. quella semplice o progressiva;

    2. quella a stadi;

    3. quella a gradiente di potere eluente.

Nel primo metodo la fase mobile rimane la medesima durante tutta l'eluizione e le sostanze escono dalla colonna in una successione che dipende dai loro coefficienti di ripartizione. L'eluizione a stadi si utilizza quando si vogliono separare due sostanze che presentano un coefficiente di ripartizione molto diverso tra la fase fissa e la fase mobile utilizzate. Nell'eluizione a gradiente di potere eluente la variazione della composizione della fase mobile, anziché brusca come nel metodo a stadi è progressiva; il gradiente di composizione può essere lineare, esponenziale o parabolico. Questo metodo di eluizione viene utilizzato soprattutto quando le sostanze che costituiscono la miscela in studio presentano valori assai diversi dal coefficiente di ripartizione tra fase fissa e fase mobile.
La separazione delle sostanze risulta migliore quando lo straterello di miscela introdotto inizialmente alla sommità della colonna cromatografica non subisce, per ogni sostanza, alcuna deformazione durante il processo cromatografico. Tale condizione si verifica più facilmente quando la quantità sottoposta a processo cromatografico è piccola rispetto al volume dell'eluente ed alle dimensioni della colonna cromatografica, e quando il rapporto tra la lunghezza ed il diametro della colonna è sufficientemente elevato.
Si può parlare di cromatografia "ideale" e cromatografia "non ideale".(Cromatografia ideale), si suppone che i processi di scambio tra fase fissa e mobile siano reversibili, che gli equilibri delle sostanze tra le fasi siano raggiunti istantaneamente, e che nessuno dei componenti il miscuglio turbi l'equilibrio di ripartizione delle altre sostanze.Nel caso della Cromatografia non ideale, i processi parassiti dovuti al mancato raggiungimento dell'equilibrio di ripartizione delle sostanze tra le fasi, all'incompleta reversibilità del processo di ripartizione, alla decomposizione delle sostanze durante la cromatografia ecc., si manifestano in diversa misura. A seconda dei casi, essi possono disturbare ed anche impedire la separazione dei prodotti che formano la miscela sottoposta alla tecnica cromatografica.

Isoterma di ripartizione ideale e non ideale

Grazie alla cromatografia ideale, più semplice da affrontare rispetto a quella non ideale, i fondamenti teorici della cromatografia possono costruirsi introducendo una grandezza caratteristica dell'equilibrio statico di ripartizione della sostanza cromatografata tra fase fissa e fase mobile. Questo equilibrio può essere rappresentato, per ogni sostanza e per ogni coppia di fasi fisse e fasi mobili, da una curva detta Isoterma di Ripartizione che indica per ogni concentrazione del prodotto nella fase mobile Cm la concentrazione dello stesso prodotto nella fase fissa Cf.
Queste isoterme sono delle curve che volgono la loro concavità verso l'asse delle Cm. Il tipo di isoterma ha una notevole importanza; nel caso in cui l'isoterma sia una retta, lo strato di sostanza non si deforma durante il processo cromatografico.
Nel caso di un'isoterma a concavità rivolta verso l'asse dei Cm, la teoria prevede (e l'esperienza conferma) che lo strato di sostanza si deformi durante il suo passaggio lungo la colonna.
In questo caso la curva rappresentativa è non simmetrica, poiché la concentrazione decresce da valle a monte.
L'asimmetria della distribuzione della concentrazione nei singoli strati ne determina la sovrapposizione; ne consegue che, nel diagramma della concentrazione dei componenti in funzione del volume di eluente che ha attraversato la colonna, la curva si presenti non come insieme di picchi ben separati, ma come una serie di curve appiattite, che possono parzialmente sovrapporsi. Questi fenomeni si osservano particolarmente nella cromatografia di adsorbimento in fase liquida o in fase gassosa.
Il riempimento del tubo da cromatografia con il materiale
adsorbente deve essere condotto in modo da evitare nella colonna qualsiasi irregolarità perché questa si tradurrebbe in una deformazione dei fronti di eluizione e cioè in separazioni imperfette. Colonne ben omogenee si possono ottenere con due diverse tecniche di riempimento.

Eluizione di una miscela a isoterma non lineare

Nel riempimento a secco il materiale adsorbente viene introdotto a piccole porzioni che si assestano successivamente nel tubo battendolo sul fianco o pressando con una bacchetta di largo diametro; l'operazione è importante perché, quanto maggiore è il tasso di riempimento del tubo, tanto più fini sono le separazioni che si ottengono. Formata così la colonna, si pressa sopra di essa un primo disco di carta da filtro di diametro pari a quello del tubo, poi un secondo di diametro superiore che rimane, perciò, legato ai bordi. I due dischi evitano, quando si introducono nella colonna le soluzioni, che il moto del liquido porti in sospensione lo straterello superiore di materiale adsorbente. Con questo sistema, però, non è sempre facile ottenere una colonna perfettamente omogenea ed evitare la formazione di bolle d'aria al suo interno.

Separazione di coloranti organici su una colonna di amido

Nella tecnica di riempimento 

a umido

Separazione di pigmenti di un estratto di foglie

il materiale adsorbente viene, invece, introdotto nel tubo cromatografico sotto forma di sospensione nel solvente che verrà poi usato per la cromatografia. L'assestamento del solido si facilita applicando all'uscita inferiore della colonna una leggera aspirazione avendo, però, cura che il solido stesso rimanga in ogni momento ricoperto dal solvente. Si introducono, così, altre piccole quantità di adsorbente, fino a che la colonna abbia raggiunto l'altezza voluta. Infine, si sistemano sulla sua estremità superiore due dischetti di carta da filtro nel modo descritto per il riempimento a secco. La tecnica di riempimento ad umido presenta meno di quella a secco il pericolo della formazione di bolle d'aria in seno alla colonna. Per evitarlo del tutto, si può preventivamente riempire il tubo con solvente puro e lasciarvi cadere l'adsorbente, a piccole porzioni, battendo lateralmente il tubo stesso con un martelletto di gomma. Prima dell'introduzione della miscela da separare si versa sopra la colonna, che comunque si sarà sempre mantenuta ricoperta dal solvente, un'altra piccola quantità di solvente, che si lascia poi percolare attraverso la colonna fino a quando questa rimane coperta solo da uno strato molto basso di liquido. A questo punto, si introduce cautamente la soluzione della miscela da risolvere. É importante che questa formi sulla colonna una zona di adsorbimento molto ristretta; se la zona è troppo larga, le bande di eluizione devono poi percorrere un cammino maggiore per potersi separare nettamente, e comporta l'uso di colonne di lunghezza eccessiva.
Il solvente impiegato per l'eluizione è assai spesso quello utilizzato per solubilizzare le sostanze da separare.

 

 

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