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Introduzione all'HPLC

Benvenuti  nel sito dell' HPLC  

Inquesta pagina , spieghiamo un po di Teoria     

PAGINA6

STEROIDI - ZUCCHERI  - LIPIDI  - AMMINOACIDI



Amminoacidi

Si può affermare che un po' tutti i metodi cromatografici sono stati impiegati per lo studio degli amminoacidi; negli ultimi anni sono state descritte numerose tecniche di separazione su strato sottile con gli adsorbenti più vari: gel di silice, cellulosa, celite, amido e gel di silice mescolato a terra silicea. Tuttavia la cromatografia su carta e quella su colonna a scambio ionico sembrano essere ancora i metodi elettivi per l’analisi degli amminoacidi contenuti nei liquidi biologici.
La cromatografia su carta è il metodo più usato nella pratica clinica per la determinazione degli amminoacidi. Si tratta di un metodo semplice ed economico ed è anche possibile la contemporanea analisi di più campioni. Va sottolineato, tuttavia, che l'interpretazione dei dati va fatta con cautela poichè questa metodica è essenzialmente qualitativa. Essa può essere considerata al massimo semiquantitativa quando il campione da analizzare sia stato precedentemente desalificato. Nonostante questa limitazione, la cromatografia su carta degli amminoacidi sierici e urinari è giustamente considerata uno dei metodi più utili nella diagnostica di laboratorio. Con mezzi complessi come le urine e il sangue è indispensabile eseguire una cromatografia bidimensionale.
La cromatografia su colonna a scambio
ionico permette la contemporanea determinazione quantitativa di vari amminoacidi contenuti in un determinato campione, anche se presenti in piccola quantità. Allo stato attuale è questa la metodica più indicata per lo studio delle malattie metaboliche congenite o acquisite che si accompagnano alla modificazione della composizione degli amminoacidi ematici e urinari, e non è necessaria la preliminare desalificazione del campione.
Gli inconvenienti sono costituiti dal costo elevato delle apparecchiature, dai tempi di esecuzione spesso lunghi e dalle necessità di personale qualificato, anche se la recente introduzione di apparecchi automatizzati ha notevolmente ridotto gli inconvenienti suddetti.

Zuccheri

L’identificazione e la determinazione di mono- e di-saccaridi nei liquidi biologici e di estrema utilità nella diagnosi di alcune malattie ereditarie dovute alla deficienza di uno degli enzimi preposti al metabolismo degli zuccheri.
L’individuazione di molti quadri morbosi dovuti ai difetti suddetti è stata resa possibile proprio grazie all’applicazione clinica delle metodiche cromatografiche. Il metodo più comunemente impiegato è la cromatografia su carta; tuttavia da alcuni anni si preferisce la cromatografia su strato sottile.
A scopo diagnostico è spesso sufficiente la sola ricerca qualitativa. Il campione biologico prima della cromatografia deve essere desalificato, perchè la presenza di sali può alterare la migrazione sulla carta e interferire con lo sviluppo della colorazione dopo l’applicazione del reattivo, specie quando vengono usati sistemi solventi basici.
Per l’identificazione di alcuni zuccheri può essere necessario l’impiego di diversi sistemi solventi o, nel caso della cromatografia su strato sottile, di differenti supporti.

Lipidi

La cromatografia su strato sottile e la gascromatografia sono le metodiche di gran lunga più usate nello studio dei lipidi.
Un’accurata analisi quantitativa e qualitativa di questi, anche se presenti in piccole quantità nei campioni biologici (sangue, latte, etc.), é resa possibile dall’impiego associato delle due tecniche cromatografiche. Il sistema di scelta per lo studio completo dell’estratto lipidico è costituito da una prima separazione (su strato sottile di
gel di silice) nelle singole classi lipidiche.
Le zone corrispondenti al punto di migrazione delle frazioni vengono eluite, metilate e sottoposte ad analisi gascromatografica. Grazie ad essa si può risalire alla determinazione quantitativa degli acidi grassi contenuti nella frazione in esame.
La corretta esecuzione di questo metodo permette determinazioni accurate per cui questo viene considerato il metodo elettivo soprattutto per la determinazione dei trigliceridi. Senza ulteriori analisi è possibile, inoltre, ottenere informazioni sulla concentrazione dei singoli acidi grassi.

Ormoni steroidei

Lo studio del metabolismo degli ormoni steroidei ha subito un notevolissimo impulso con l’introduzione nella pratica di laboratorio della cromatografia su strato sottile e della gascromatografia.
L’impiego della cromatografia per lo studio degli steroidi estratti dalle urine viene praticato dopo idrolisi degli ormoni solfo- o glucurono-coniugati per purificare preliminarmente l’estratto e per frazionarlo in gruppi di composti simili. Per questo scopo viene preferita la cromatografia su strato sottile.
Per migliorare le prestazioni della gascromatografia si usano rivelatori a ionizzazione di argon, che sono stati usati più frequentemente negli anni trascorsi, e quelli a ionizzazione di fiamma che sembra stiano attualmente guadagnando in affidabilità. I rilevatori a cattura di elettroni hanno dato risultati inferiori ai due precedenti.
La determinazione degli steroidi circolanti nel sangue è stata perfezionata negli ultimi anni con la "doppia diluizione isotopica" che permette di ottenere risultati precisi anche per quantità di sostanze inferiori al nanogrammo.
La purificazione degli ormoni estratti è, spesso, ottenuta con l’impiego della cromatografia su carta.

 

  

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