HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAFIA
Un altro tipo di cromatografia per ripartizione
è nata poi, nel 1944, per opera dello stesso Martin e dei suoi collaboratori
una particolare metodologia: quella della cromatografia su carta.
Questo tipo di cromatografia, come quella su strato sottile è di superficie, le
cui modalità operative rimangono in parte le medesime: su una linea orizzontale
distante pochi centimetri dal bordo del foglio o dello strato sottile si
depositano dei piccoli volumi della soluzione della sostanza o della miscela in
un solvente volatile.
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Dopo avere evaporato il solvente dalle macchiette di soluzione così disposte,
si introduce l'estremità del foglio o dello strato sottile in una vaschetta
contenente un solvente adatto, disponendo il tutto in un ristretto ambiente
chiuso, ad esempio sotto una campana di vetro o in una cassetta a vetri
apribili. Le sostanze migrano nella carta o salendo per capillarità (vaschetta
in basso, foglio tenuto verticale appeso ad un sostegno: cromatografia
ascendente) o discendendo (vaschetta in alto, foglio verticale: cromatografia
discendente). Il solvente si sposta per capillarità lungo il foglio o lungo lo
strato sottile e, giunto all'altezza delle macchiette della sostanza, le
trascina gradualmente nel senso del suo spostamento; per una identica migrazione
del fronte del solvente, le distanze percorse dalle macchiette delle singole
sostanze che costituiscono una miscela risultano in genere diverse l'una
dall'altra.
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Dopo un certo cammino, si estrae il foglio di materiale fibroso o la lastrina
con il suo strato sottile dalla vaschetta contenente il solvente e li si essicca
in corrente d'aria a temperatura ambiente oppure in stufa.
La posizione raggiunta dalle macchiette lungo una linea verticale, disposta cioè
nel senso dello spostamento del solvente, che viene subito segnata ad esempio
con la punta di una matita, può essere individuata direttamente nel caso di
sostanze colorate; altre volte si evidenzia con adatti metodi fisici (esaminando
il cromatogramma a luce ultravioletta, o per autoradiografia cioè nel caso di
composti che presentano isotopi radioattivi). Nella cromatografia su foglio si
impiegano solitamente fogli di carta da filtro standardizzati, fogli di fibra di
vetro o di carta contenente resine scambiatrici di ioni, ecc.
su strato sottile, l'adsorbente, polverulento, è del tipo di quelli
utilizzati anche per la cromatografia su colonna; può essere costituito da
adsorbenti non specifici, come l'allumina per cromatografia, il gel di silice,
particolari silicati di magnesio, ecc. oppure può essere costituito da un
adsorbente specifico per determinati prodotti.
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Il materiale utilizzato per la preparazione degli strati sottili contiene
talvolta un legante quale gesso, amido solubile ecc, che ha lo scopo di
conferire al materiale adsorbente un minimo di compattezza.
La cromatografia su strato sottile è detta anche cromatografia laminare: è una
forma di cromatografia piuttosto simile a quella su carta, ma in realtà è una
forma di cromatografia per adsorbimento. In essa, infatti, al foglio di carta si
sostituisce una lastra di vetro sulla quale si deposita, con un apposito
strumento distributore e livellatore, uno strato sottile di sostanza adsorbente.
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Sulla lastra così preparata si pone la soluzione e si fanno migrare i solventi
come nella cromatografia ascendente su carta, usando solventi organici puri o in
miscela (acquosi o meno) in modo da variare polarità e pH del mezzo a seconda
delle sostanze da separare. Il sistema permette di lavorare su materiale
strettamente omogeneo, in cui quindi le separazioni avvengono in modo assai
regolare; le separazioni hanno luogo con notevole rapidità e la rivelazione può
risultare anche estremamente agevole.
Per la sua praticità ed esattezza in molti campi, questo metodo si sta
sviluppando con grande rapidità. Questo tipo di cromatografia prevede l'uso di
apparecchi stenditori e, in assenza di questi, si può applicare l'adsorbente
manualmente.
La differenza sostanziale fra questo tipo di cromatografia e quella su carta
viene dal fatto che nella cromatografia su strato sottile si opera con una fase
solida finemente suddivisa, costituita da particelle minutissime e che, in prima
approssimazione, possano considerarsi come altrettante sferette, mentre in
quella su foglio la fase solida è costituita da un materiale fibroso a
struttura continua.
Nella cromatografia su strato sottile si possono realizzare tutti i diversi tipi
di cromatografia e cioè quelli per adsorbimento, per partizione tra solventi
diversi, per scambio ionico e per esclusione - diffusione.che segue sono
rappresentati due fogli per cromatografia:
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il primo è ritagliato nel lembo inferiore in modo da formare dei denti che
rendono regolare lo sgocciolamento della fase mobile se questa deve superare il
lembo stesso: tale avvertenza è superflua se, come nella figura a destra(cromatografia
monodimensionale) il fronte del solvente L L' non deve raggiungere il bordo
inferiore del foglio. A, B, C, D, E, I, T sono i punti di applicazione di
singole sostanze pure sulle linee di partenza l, l' M' il punto di applicazione
di una miscela di A, B e C, M" quello di una miscela di D, E, I e T; i
cerchietti punteggiati rappresentano la posizione raggiunta dalle singole
macchiette dopo lo sviluppo.
si tratta di esaminare una miscela costituita da un numero alquanto elevato di
componenti, è opportuno ricorrere allo sviluppo cosiddetto bidimensionale;
nella figura sopra è riportato il cromatogramma ottenuto con cromatografia
bidimensionale di una miscela di acidi organici costituita da acido lattico,
sebacico, glicolico, adipico, maleico, malonico, succinico, tartarico, malico,
citrico, aconitico e ossalico.
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La soluzione della miscela si applica in un angolo della superficie
cromatografica, si procede ad un primo sviluppo e poi, dopo aver estratto il
foglio o lo strato sottile dal solvente ed evaporato quest'ultimo fino a secco,
si ruota il foglio o lo strato sottile di 90° e si procede ad un secondo
sviluppo mediante un'altra fase mobile che si fa correre in direzione
perpendicolare a quella in cui si era spostata la prima.
Quando la mobilità cromatografica delle sostanze che si esaminano viene ad
essere nelle condizioni adottate, assai scarsa, può essere utile far scorrere
il solvente anche dopo che il suo fronte ha raggiunto il limite dello strato
cromatografico.
L'operazione viene compiuta in recipienti chiusi saturi di vapori del liquido
impiegato. É evidente che l'acqua contenuta nel miscuglio di solventi imbeverà
la cellulosa della carta costituendovi la fase stazionaria, sulla quale
scorreranno gli altri solventi (fase mobile). In tal modo i vari componenti del
miscuglio da analizzare migreranno lungo una retta, così come avviene nella
cromatografia su colonna, generando una serie di macchie opportunamente
distanziate. La cromatografia detta bidimensionale, per distinguerla da quella
unidimensionale, è operata in un unica direzione e con un solo miscuglio di
solventi. Se il foglio di carta viene ruotato di 90° e vi viene fatto migrare
in direzione ortogonale alla prima un miscuglio di solventi diverso dal
precedente e scelto opportunamente, è
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possibile ripetere una cromatografia, in cui ogni macchia derivata dalla prima
operazione si comporta come punto di partenza per una seconda operazione in
condizione diverse dalla prima.
Cromatogrammi Circolari
e radiali si possono ottenere facendo migrare i solventi dal centro di un
disco di carta, disponendo vicino al centro stesso il miscuglio da analizzare.
Quando le sostanze da
separare sono gassose o volatili si ha la gascromatografia,
detta anche cromatografia in fase gassosa.
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