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Introduzione all'HPLC

Benvenuti  nel sito dell' HPLC  

Inquesta pagina , spieghiamo un po di Teoria     

PAGINA 2
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAFIA

   

Cromatografia su carta ascendente e discendente

Un altro tipo di cromatografia per ripartizione è nata poi, nel 1944, per opera dello stesso Martin e dei suoi collaboratori una particolare metodologia: quella della cromatografia su carta. Questo tipo di cromatografia, come quella su strato sottile è di superficie, le cui modalità operative rimangono in parte le medesime: su una linea orizzontale distante pochi centimetri dal bordo del foglio o dello strato sottile si depositano dei piccoli volumi della soluzione della sostanza o della miscela in un solvente volatile.

Separazione degli amminoacidi di succo di arancia

Dopo avere evaporato il solvente dalle macchiette di soluzione così disposte, si introduce l'estremità del foglio o dello strato sottile in una vaschetta contenente un solvente adatto, disponendo il tutto in un ristretto ambiente chiuso, ad esempio sotto una campana di vetro o in una cassetta a vetri apribili. Le sostanze migrano nella carta o salendo per capillarità (vaschetta in basso, foglio tenuto verticale appeso ad un sostegno: cromatografia ascendente) o discendendo (vaschetta in alto, foglio verticale: cromatografia discendente). Il solvente si sposta per capillarità lungo il foglio o lungo lo strato sottile e, giunto all'altezza delle macchiette della sostanza, le trascina gradualmente nel senso del suo spostamento; per una identica migrazione del fronte del solvente, le distanze percorse dalle macchiette delle singole sostanze che costituiscono una miscela risultano in genere diverse l'una dall'altra.

 

Cromatografia su carta di inchiostri

Dopo un certo cammino, si estrae il foglio di materiale fibroso o la lastrina con il suo strato sottile dalla vaschetta contenente il solvente e li si essicca in corrente d'aria a temperatura ambiente oppure in stufa. La posizione raggiunta dalle macchiette lungo una linea verticale, disposta cioè nel senso dello spostamento del solvente, che viene subito segnata ad esempio con la punta di una matita, può essere individuata direttamente nel caso di sostanze colorate; altre volte si evidenzia con adatti metodi fisici (esaminando il cromatogramma a luce ultravioletta, o per autoradiografia cioè nel caso di composti che presentano isotopi radioattivi). Nella cromatografia su foglio si impiegano solitamente fogli di carta da filtro standardizzati, fogli di fibra di vetro o di carta contenente resine scambiatrici di ioni, ecc. su strato sottile, l'adsorbente, polverulento, è del tipo di quelli utilizzati anche per la cromatografia su colonna; può essere costituito da adsorbenti non specifici, come l'allumina per cromatografia, il gel di silice, particolari silicati di magnesio, ecc. oppure può essere costituito da un adsorbente specifico per determinati prodotti.

Cromatografia su strato sottile di coloranti per grassi

 

Il materiale utilizzato per la preparazione degli strati sottili contiene talvolta un legante quale gesso, amido solubile ecc, che ha lo scopo di conferire al materiale adsorbente un minimo di compattezza. La cromatografia su strato sottile è detta anche cromatografia laminare: è una forma di cromatografia piuttosto simile a quella su carta, ma in realtà è una forma di cromatografia per adsorbimento. In essa, infatti, al foglio di carta si sostituisce una lastra di vetro sulla quale si deposita, con un apposito strumento distributore e livellatore, uno strato sottile di sostanza adsorbente.

Cromatografia su strato sottile: separazione dei lipidi del pistacchio
Sulla lastra così preparata si pone la soluzione e si fanno migrare i solventi come nella cromatografia ascendente su carta, usando solventi organici puri o in miscela (acquosi o meno) in modo da variare polarità e pH del mezzo a seconda delle sostanze da separare. Il sistema permette di lavorare su materiale strettamente omogeneo, in cui quindi le separazioni avvengono in modo assai regolare; le separazioni hanno luogo con notevole rapidità e la rivelazione può risultare anche estremamente agevole.
Per la sua praticità ed esattezza in molti campi, questo metodo si sta sviluppando con grande rapidità. Questo tipo di cromatografia prevede l'uso di apparecchi stenditori e, in assenza di questi, si può applicare l'adsorbente manualmente.
La differenza sostanziale fra questo tipo di cromatografia e quella su carta viene dal fatto che nella cromatografia su strato sottile si opera con una fase solida finemente suddivisa, costituita da particelle minutissime e che, in prima approssimazione, possano considerarsi come altrettante sferette, mentre in quella su foglio la fase solida è costituita da un materiale fibroso a struttura continua.
Nella cromatografia su strato sottile si possono realizzare tutti i diversi tipi di cromatografia e cioè quelli per adsorbimento, per partizione tra solventi diversi, per scambio ionico e per esclusione - diffusione.che segue sono rappresentati due fogli per cromatografia:
Schemi di cromatografia monodimensionale discendente
 

il primo è ritagliato nel lembo inferiore in modo da formare dei denti che rendono regolare lo sgocciolamento della fase mobile se questa deve superare il lembo stesso: tale avvertenza è superflua se, come nella figura a destra(cromatografia monodimensionale) il fronte del solvente L L' non deve raggiungere il bordo inferiore del foglio. A, B, C, D, E, I, T sono i punti di applicazione di singole sostanze pure sulle linee di partenza l, l' M' il punto di applicazione di una miscela di A, B e C, M" quello di una miscela di D, E, I e T; i cerchietti punteggiati rappresentano la posizione raggiunta dalle singole macchiette dopo lo sviluppo.

Cromatografia bidimensionale di mioglobina di cuore di tonno
si tratta di esaminare una miscela costituita da un numero alquanto elevato di componenti, è opportuno ricorrere allo sviluppo cosiddetto bidimensionale; nella figura sopra è riportato il cromatogramma ottenuto con cromatografia bidimensionale di una miscela di acidi organici costituita da acido lattico, sebacico, glicolico, adipico, maleico, malonico, succinico, tartarico, malico, citrico, aconitico e ossalico.
Cromatografia bidimensionale di una miscela
 

La soluzione della miscela si applica in un angolo della superficie cromatografica, si procede ad un primo sviluppo e poi, dopo aver estratto il foglio o lo strato sottile dal solvente ed evaporato quest'ultimo fino a secco, si ruota il foglio o lo strato sottile di 90° e si procede ad un secondo sviluppo mediante un'altra fase mobile che si fa correre in direzione perpendicolare a quella in cui si era spostata la prima.
Quando la mobilità cromatografica delle sostanze che si esaminano viene ad essere nelle condizioni adottate, assai scarsa, può essere utile far scorrere il solvente anche dopo che il suo fronte ha raggiunto il limite dello strato cromatografico.
L'operazione viene compiuta in recipienti chiusi saturi di vapori del liquido impiegato. É evidente che l'acqua contenuta nel miscuglio di solventi imbeverà la cellulosa della carta costituendovi la fase stazionaria, sulla quale scorreranno gli altri solventi (fase mobile). In tal modo i vari componenti del miscuglio da analizzare migreranno lungo una retta, così come avviene nella cromatografia su colonna, generando una serie di macchie opportunamente distanziate. La cromatografia detta bidimensionale, per distinguerla da quella unidimensionale, è operata in un unica direzione e con un solo miscuglio di solventi. Se il foglio di carta viene ruotato di 90° e vi viene fatto migrare in direzione ortogonale alla prima un miscuglio di solventi diverso dal precedente e scelto opportunamente, è

Cromatografia circolare su carta
possibile ripetere una cromatografia, in cui ogni macchia derivata dalla prima operazione si comporta come punto di partenza per una seconda operazione in condizione diverse dalla prima.
Cromatogrammi Circolari e radiali si possono ottenere facendo migrare i solventi dal centro di un disco di carta, disponendo vicino al centro stesso il miscuglio da analizzare.

Cromatografia circolare su carta di cationi inorganici





 

Quando le sostanze da separare sono gassose o volatili si ha la gascromatografia, detta anche cromatografia in fase gassosa.